mRNA疫苗在covid-19疫情出圈后，基于mRNA开发新疗法更加受到关注，包括mRNA传染病疫苗、肿瘤免疫疗法（癌症疫苗）、治疗性蛋白质替代疗法和遗传疾病治疗等。 

基于mRNA技术的covid-19广泛使用。目前，全球范围内已有2种mRNA疫苗获得FDA的EUA（紧急使用授权），分别是由德国BioNTech、辉瑞和复星医药共同研发的BNT162b2（有效率95%）以及美国Moderna公司研发的mRNA-1273（有效率94.1%）。

在国内，由沃森生物、苏州艾博生物、军事科学院军事医学研究院共同研制的mRNA covid-19ARCoV将于5月30日起在墨西哥开始III期试验；斯微生物的mRNA疫苗也进入了I期临床试验。

既然mRNA疫苗这么受欢迎，今天我们就来讲讲mRNA疫苗是如何体外制备的。

mRNA疫苗的制备

以covid-19为例，我们首先分离出病毒株，测序及分析获得病毒的完整基因序列，然后通过基因工程技术，利用化学合成的方式，合成S刺突蛋白所对应的病毒RNA片段，为了方便接下来的RNA大量复制，RNA片段首先在DNA聚合酶的作用下，发生逆转录合成双链DNA结构。在基因克隆技术中，通常将要复制的DNA嵌入到载体质粒中，利用细菌快速繁殖，培养，复制出大量嵌入S蛋白DNA质粒的细菌，经过提取，分离，纯化等工艺，得到大量纯净S蛋白DNA。S蛋白DNA通过使用转录试剂完成体外转录得到大量mRNA,mRNA单独存在时结构并不稳定，所以在最终制成疫苗时，需要在mRNA外层包裹一层脂类，最终完成mRNA疫苗的制备。

mRNA的结构及优化策略

1 mRNA加帽

真核细胞mRNA的5'端有一个帽子结构，它是在mRNA转录后，由甲基化的鸟苷酸（m7G）经焦磷酸化与mRNA的5'端核苷酸相连。5'端帽子结构在mRNA许多生物学功能中起到重要的作用，这包括：mRNA的剪切、稳定、转运和核糖体的募集等。由于5'端帽子结构的重要生物学功能，在mRNA疫苗研发过程中需要优化5'端帽子结构，并利用合适的工艺对mRNA原料进行“加帽”。

mRNA疫苗产品的加帽可以在mRNA的体外转录过程中通过掺入“帽子序列”实现，这种加帽技术会将加帽序列反向加在mRNA上，这会导致约1/3的加帽失败。通过掺入特殊的帽子结构——“anti-reverse”帽子结构（ARCA）可以降低这种反向加帽失误的出现。另外，还可以先合成不带帽子结构的mRNA，再利用痘病毒的“加帽复合物”对mRNA进行加帽，这也是一种mRNA的加帽手段。

2.非翻译区序列（UTRs）修饰

在mRNA的编码区两端各存在一段非翻译区（UTRs），在5'端的被称为5'端UTR，在3'端的被称为3'端UTR。

非翻译区序列不是密码子，不能翻译成氨基酸，但是可以通过RNA结合蛋白控制mRNA产品的降解和转录效率。因此，每一种mRNA疫苗都需要考虑如何设计产品的UTR组件，进而提高在目的细胞中mRNA疫苗的稳定性和转录效率。大量的研究发现非洲爪蟾和人源的α-球蛋白/β-球蛋白的UTR序列非常稳定，而且能够增加异源的mRNA的表达效率，因此这两个蛋白的UTR原件通常被设计为mRNA疫苗的UTR组件。当然，也有其它蛋白的UTRs被研究用于mRNA疫苗的组件，在此不再赘述。

3.Poly（A）

大多数真核生物的mRNA 的3'端都有由100~200个腺苷酸聚合形成的Poly（A）尾巴。mRNA的Poly（A）尾巴可以和5'端帽子结构共同合作，增强mRNA结构的稳定性。Poly（A）尾巴首先和大量的Poly（A）结合蛋白（PABP）结合，然后募集真核生物起始因子4G（eIF4G），增加Poly（A）跟5'端帽子结构的亲和力，最终mRNA的Poly（A）尾巴和5'端帽子结构首尾相接，形成环装mRNA。环装mRNA结构有利于核糖体的募集，其特殊的结构也能保护mRNA不被降解。

在mRNA体外合成过程中，Poly（A）尾巴可以通过质粒DNA模板转录获得，也可以先合成mRNA再通过Poly（A）聚合酶加上不同单位数量的尾巴。前者能够在mRNA产品中加入特定数目的Poly（A），而后者加入的单位数不确定。

Poly（A）尾巴的单位数目对于其生物学作用起到了至关重要的作用。在哺乳动物细胞内，活跃表达的mRNA包含的Poly（A）序列的长度为100-250个。有研究发现，表达效率越高的mRNA，其Poly（A）尾巴越短。但是当Poly（A）单位长度小于12时，mRNA结构就不再稳定，容易被降解。在设计mRNA疫苗产品的序列时，Poly（A）的长度也是非常重要的优化指标。

4. 开放阅读框

开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）包涵了mRNA的全部编码序列，负责进入人体后表达mRNA运载的抗原靶蛋白。

密码子水平的修饰，利用常用的密码子，选用tRNA较多的密码子；使各个密码子的比例更接近靶物种或者细胞的比例；

GC含量的修饰，避免复杂二级结构形成；二级结构对mRNA的延伸和转录非常重要，高稳定的二级结构和发夹结构需要避免。这样的二级结构可以阻止核糖体的进入、扫描以及容易被先天性免疫识别为PAMP。

mRNA疫苗制备试剂盒：

Cellscript   T7 mScript™ Standard mRNA Production System  C-MSC11610/C-MSC100625

该试剂盒包含T7 RNA聚合酶，加帽酶，加尾酶，以及2'-O-甲基转移酶， 可以一站式解决mRNA制备过程。

T7-FlashScribe™ Transcription Kit  C-ASF3507  以1ug线性化的DNA为模板，在30min内体外转录可以得到180ug的RNA。

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北京和一生物作为Cellscript的国内授权代理，为你提供CellScript公司全套的mRNA生产的原料，目前产品主要包括体外转录试剂盒，帽类似物，加帽酶，加尾酶，以及一些修饰核苷等等，北京和一生物为你提供全套mRNA制备的解决方案，助力抗击covid-19，期待你的咨询！