1. 配制培养基: DMEM=内酮酸钠++10%血清++青链毒素

2. 复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15m离心管，加5ml培养基500g离心5min,弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。

3. 传代：吸出旧培基，加5mIPBS洗一遍，用移液管加1ml胰酶，洗一遍吸出，37度放1min左右计时看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。

293T细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖

哺乳细胞的大规模培养方式有三种:贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。293T细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生

长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。

单层培养细胞在 5-10%FBS-DMEM 中能生长很好。一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散

悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。293T 细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞

293T细胞培养特性:

1. 细胞明显适应酸性环境pH值在6.9~7.1时可顺利贴壁生长换液293T时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基

2、传代: 倒去废液，PBS 洗一次 (轻)，用0.02%EDTA与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化 30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化,反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时 90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达 80-90%汇合，传代比例为1:3。

3、293 细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存

4、复苏：293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%~80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml 瓶中时较为合适。刚复苏的 293 贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48 小时左右观察贴壁情况并进行更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热

5转染: 体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸转染，一定要注意 293 细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使 293 细胞大片的脱落，最好是当293生长到 1/2或2/3 时进行磷酸转染，可以避免细胞的大量脱落

1.Corning® DMEM培养基

2. Corning® CellBIND® 6孔透明多孔板，平底，带盖，无菌  （产品编号3335  5/包 ）

3. Corning® CellBIND® 12孔透明多孔板，平底，带盖，无菌   （产品编号3336  5/包 ）

4. Corning® CellBIND® 24孔透明多孔板，平底，带盖，无菌 （产品编号3337  5/包）

5. Corning® Donor Horse Serum, 500 mL, United States Origin  （产品编号：35-030-CV ）